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目前常用的细胞增殖标记物有4种，DNA聚合酶α(DNA polymerase α)，增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen，PCNA)，Ki-67和5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)。其中Brdu为组织细胞非内源性表达存在，应用相对较广。Brdu，也称为溴化去氧尿苷，一种合成的胸苷类似物，在S期可替代胸腺嘧啶核苷选择性结合到细胞DNA中。从而检测细胞DNA合成和标记细胞分裂，凋亡等行为。在遗传研究中Brdu可通过活体注射或细胞培养加载，然后使用抗Brdu的单克隆抗体进行特异性标记，ICC或IHC法染色法显示增殖细胞。另外，还能同时结合其它细胞标记物，双重染色，来判断增殖细胞的种类，增殖速度等，对研究细胞动力学有着重要意义。

中文别名	5-溴-1-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖)尿嘧啶；5-溴脱氧尿苷；溴化去氧尿苷；
英文别名	Br-dU;BUdR;5-BrdU;5-Bromodeoxyuridine;
CAS号	59-14-3
分子式	C9H11BrN2O5
分子量	307.10
外观	白色或类白色粉末
熔点	187～189℃
纯度	≥99%
溶解性	溶于1M氢氧化铵(50mg/mL)，水(高达10mg/mL)；溶于DMF，DMSO，水(加热)(50～100mg/mL)
结构式

• 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
  
• 该品对肌体有不可逆损伤的可能性。使用时应穿防护服和戴手套。应避免吸入本品的粉尘。
  
• 本制品仅作科研用途！

• Brdu储存液的准备：
  用1×DPBS充分溶解适量的Brdu配置10mg/mL的母液，过滤除菌后，按照0.5mL/管的量分装放在-20℃或者-80℃长期保存，避免反复冻融。Brdu储存液再融化后，4℃可稳定存放一周。
  
• 体内Brdu标记
  
  • 腹腔注射法(常用)：无菌的10mg/mL(溶于DPBS)适合用于体内注射用。按照100～200μL(1～2mg) Brdu的量腹腔注射到小鼠体内。注意：最短在注射后0.5h后在小肠，胸腺和骨髓瘤处就能检测到Brdu。而一般在注射后24h内几乎所有组织都能检测到Brdu。这个时间可能对于一些快速分化的组织如小肠来说有些久。
    
  • 根据自身的实验体系，在合适的时间点处死动物，摘除待研究的组织。使用冰冻切片或者石蜡包埋的方法进行组织处理和切片制备。然后进入后续的IHC染色步骤。
• 体外Brdu标记(培养原代细胞或者细胞系)
  注：总的来说，10μM Brdu(稀释于培养液)是一个比较合适的方法用来标记不同物种来源的原代细胞或细胞系。当然，建议针对具体的实验体系优化方法。
  
  • 在96孔板上按标准步骤进行细胞培养，培养时间一般为1-72h；
    
  • Brdu工作液的准备：用组织细胞培养液按照1:30的比例稀释储存液得到1mM Brdu工作液。然后取10μL 1mM Brdu溶液直接加入1mL组织培养液即得到最终工作液。37℃温热。
    
  • 按100μL/孔Brdu工作液的量进行细胞标记，37℃孵育60min~过夜。同时设置非Brdu标记的细胞作为阴性对照。注意：最佳的孵育时间取决于细胞增殖速度以及需要达到的实验目的。比如，对于快速增殖细胞(如HL-60)有效孵育时间为30～45min；对于原代细胞(如未受外源刺激培养的外周血淋巴细胞)孵育时间可能需要24h。细胞密度最好不要超过2×10⁶ cells/mL。
    
  • 制备单细胞层玻片，使用以下任何一种方法：
    
    • 细胞离心涂片(cytospin)制备：使用细胞离心涂片机，将100μL标记好的细胞(浓度为：1～2×10⁶ cells/mL)直接离心到干净，无脂肪，poly-L-lysin包被的玻片上，风干。
      
    • 细胞涂片(cell-smear)制备：取一小滴标记好的细胞悬液于干净，无脂肪，poly-L-lysin包被玻片的一端，然后用第二个干净玻片将其均匀涂布成一薄层。室温风干。
  • 将玻片置于70%冰乙醇放在-20℃下固定20～30min(也可选择4%多聚甲醛固定15min)。
    
  • PBS清洗细胞3次，每次5min。
    
  • 加入2M HCl中室温孵育30min～60min。注意：DNA的变性对于Brdu染色的成功至关重要。
    
  • 吸去HCl，PBS清洗2次，每次5min。
    
  • 用0.1M Na2B4O7 (等体积步骤7)2M HCl的量)室温浸泡15min，PBS浸洗玻片3次，每次10min (适当延长时间和加大体积，完全洗净)；
    
  • 吸水纸吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室温封闭30min；
    
  • 吸水纸吸掉封闭液，勿清洗，滴加足量稀释好的一抗，并放入湿盒中，4℃孵育过夜；PBS清洗3次，每次5min；
    
  • 加入稀释好的荧光二抗，湿盒室温孵育1h；PBS清洗3次，每次5min；
    
  • 核复染：滴加DAPI，避光孵育5min～10min，PBS清洗3次，每次5min；
    
  • 用吸水纸吸干多余液体，用抗淬灭封片剂封片，于荧光显微镜下观察拍照。
• 体外Brdu标记(组织薄片)
  
  • Brdu工作液的准备：用组织细胞培养液按照1:30的比例稀释储存液得到1mM Brdu工作液。然后取10～20μL 1mM Brdu溶液直接加入1mL组织培养液即得到最终工作液。确保有足够的工作液(37℃温热)完全浸泡组织。
    
  • 用手术刀或者锋利的刀片将组织切割成约1mm厚，2mm2大小的薄片。建议在温热的培养基内进行切片，利于维持组织的活力。
    
  • 转移组织薄片至预装有10mL Brdu标记液的15mL离心管内。于37°，CO₂培养箱内孵育需要的时间。孵育时间可变，取决于组织薄片类型以及需要达到的实验目的(常用的为2-4h)。直接丢弃未用完的标记液。
    
  • 37℃ PBS清洗组织薄片，每次5min。
    
  • 使用标准的冰冻切片或者石蜡包埋切片的方法固定组织。